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    本發明之課題為提供一種已確定結晶構造之α-葡糖基橘皮苷的新穎結晶與實質地由該結晶所構成之粉體、以及作為該醫藥品原料之用途。解決課題之技術手段為提供一種α-葡糖基橘皮苷之結晶，其結晶之空間群為P21，單位格子的晶格常數為a=13.983A、b=7.620A、c=20.065A，且為α=γ=90°、β=93.475°之單斜晶系(monoclinic)，實質地由該結晶所構成之粉體及作為該醫藥品原料之用途。
    公开号:TW201319080A
    申请号:TW101127785
    申请日:2012-08-01
    公开日:2013-05-16
    发明作者:Takashi Shibuya；Seisuke Izawa
    申请人:Hayashibara Co；
    IPC主号:C07H17-00
    专利说明:
    α-葡糖基橘皮苷之結晶與其用途
    本發明，其係關於α-葡糖基橘皮苷之新穎結晶與實質地由該結晶所構成之粉體、及其用途，詳細而言，係關於由X光結晶構造解析，決定其結晶構造之α-葡糖基橘皮苷的新穎結晶與實質地由該結晶所構成之粉體、及作為該醫藥品原料之用途。
    α-葡糖基橘皮苷，係構成一種維生素P之橘皮苷的蘆丁糖(Rutinose)構造之葡萄糖的4位羥基上其1分子的葡萄糖通過α-葡萄糖苷結合來結合為橘皮苷的α-葡糖基衍生物。(參照日本特許第3060227號公報、日本特許第2805273號公報、日本特許第3989561號公報、(Y.Suzuki)等、(The First International Congress on“Vitamins and Biofactors in Life Science”(ICVB))，神戸，1991年，講演要旨4-IV-5)。α-葡糖基橘皮苷，相對於難溶於水的橘皮苷具有極高之水溶性，同時具備發揮在生物體內容易被水解之橘皮苷本來的生理活性之優良特性。因此，α-葡糖基橘皮苷比橘皮苷更容易使用，作為如同橘皮苷作用之物質，主要在食品及化妝品領域上，作為黃色著色劑、抗氧化劑、品質改良劑、美肌劑、色白劑等被使用。
    順道一提，現在作為市售的α-葡糖基橘皮苷，係以噴霧乾燥法製造，以酸酐換算含有α-葡糖基橘皮苷75至85質量%(以下，除非另外指明，本說明書質量%略記為「%」)，主要係作為偏向食品之α-葡糖基橘皮苷含有非晶質粉末(例如，商品名「林原橘皮苷S」，林原商事股份有限公司販賣；商品名「α G橘皮苷PA-T」，東洋精糖股份有限公司販賣等)，又，藉由具有α-L-鼠李糖苷酶活性之酵素(例如，橘皮苷酶)進行作用，將殘留水溶性差的橘皮苷進行分解進而改善其水溶性(參照日本特許第3833775號公報)，主要作為用於化妝品之含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質粉末(例如，商品名「α-葡糖基橘皮苷」，林原生物體股份有限公司化學研究所販賣；商品名「α G橘皮苷PS」，東洋精糖股份有限公司販賣等。以酸酐換算含有α-葡糖基橘皮苷75%以上)。
    但是，此等市售之含有α-葡糖基橘皮苷粉末，任一種都是非晶質形態的α-葡糖基橘皮苷粉末，如果只是作為食品用或化妝品用還可以，若是用於醫藥品，其純度或穩定性，甚至有效性或安全性的點來說並不完全足夠。
    另一方面，本申請人，在日本特許第3833811號公報，作為共同申請人之一人，揭示從溶解α-葡糖基橘皮苷的99%(v/v)甲醇溶液中析出α-葡糖基橘皮苷之結晶，將此經分離取得α-葡糖基橘皮苷高含有物的製造方法。但是，此時所得到之結晶，如同後述，勉強可以確認其結晶程度係微小結晶為多數相互固著之塊狀結晶，經由該結晶構造的解析等，結果並不能確定係由單一結晶形所構成者。現在，依本申請人所知，有報導對於係橘皮苷配糖基之橘皮苷素的結晶構造(參照(W.Shin)等，(Acta Cryst.)C43卷、1946-1949頁(1987年)及(S.Fujii)等，(Chem.Pharm.Bull.)第42卷，第5號，1143-1145頁(1994年))者，但對於α-葡糖基橘皮苷，該結晶構造皆無記載之報告。
    如眾所周知，關於被用於作為醫藥品之分子量相對比較小的有機化合物，有必要解明該固體物理性的理解、或製劑或保存過程中的轉移現象。在醫藥品業界，有提供良藥的使命，作為醫藥品之有機化合物若為結晶的形態時其結晶構造訊息，又，該有機化合物以天然物存在光學異構物時，關於其光學純度訊息是必需的。但是，關於α-葡糖基橘皮苷，對於其結晶構造或光學純度等的訊息皆無，變成將α-葡糖基橘皮苷作為醫藥品原料使用之際的障礙。
    本發明，其課題為提供一種α-葡糖基橘皮苷，作為醫藥品原料使用之際去除上述障礙，作為α-葡糖基橘皮苷之醫藥品原料的用途被大大開拓出來，已確定結晶構造之α-葡糖基橘皮苷的新穎結晶與實質地由該結晶所構成之粉體、以及作為該醫藥品原料之用途。
    為順利解決上述的課題對於α-葡糖基橘皮苷之結晶化經過努力研究重複討論的結果，本發明者們，將α-葡糖基橘皮苷純度95%以上的含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質粉末，以未滿5%(w/v)之濃度溶解於30至40%(v/v)的甲醇水溶液中，在低溫下花時間使其結晶化，找出藉由X光結晶構造解析來解析結晶構造而得到具備充分性狀及大小的α-葡糖基橘皮苷之單結晶，決定該結晶構造，完成了本發明。
    亦即，本發明，解決課題之技術手段為提供一種α-葡糖基橘皮苷之結晶，其結晶之空間群為P21，單位格子的晶格常數為a=13.983Å、b=7.620Å、c=20.065Å，且為α=γ=90°、β=93.475°之單斜晶系(monoclinic)。至少具有如此結晶之α-葡糖基橘皮苷結晶在本申請案提出前毫無知悉，前述α-葡糖基橘皮苷之結晶為新穎結晶。
    本發明的α-葡糖基橘皮苷之結晶，更加詳細說明為構成α-葡糖基橘皮苷分子之氧原子及碳原子具有如本說明書中表3及表4所示之原子座標。
    本發明之α-葡糖基橘皮苷結晶，在該合適的一種態樣上，實質地為單結晶形態之結晶。
    又，本發明，係藉由提供一種實質地由上述α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成之粉體來解決上述課題。
    又，本發明α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體，使用光學解析管柱供於高速液體層析分析時，含有70質量%以上作為光學異構物之α-葡糖基-(R)-橘皮苷。
    加上本發明，藉由提供一種作為醫藥品原料之本發明的α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體，來解決上述的課題。亦即，已確定結晶構造之α-葡糖基橘皮苷的新穎結晶或實質地由該結晶所構成之粉體，與以往的非晶質粉末相比較，因為提高純度或安定性容易，又因為有效性或安全性的確認也容易，所以作為醫藥品原料係極為有用。
    順道一提，橘皮苷，因為它具血管強化作用、脂質代謝改善作用、發癌抑制作用、紫外線防御作用、抗氧化作用、創傷治療作用等之藥理作用(吉岡晃一等，『Bioindustry』、第20卷、第5號、19至29頁(2003年))，期待本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體也有同樣的藥理作用，可以作為醫藥品原料用於血管系疾病治療劑、關節疾病治療劑、維生素C缺乏症治療劑等之有效成分。
    根據本發明的α-葡糖基橘皮苷結晶，因為該結晶構造明確，得到作為醫藥品原料使用時所必需的α-葡糖基橘皮苷之物理的．化學的性質的解明、或包含結晶多態有無之多態性解明變成極為容易的優點。又，作為本發明的α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體使用時，其有效性或安全性的確認變為更加容易，期待具有與橘皮苷原本藥理效果同樣的藥理效果，作為與橘皮苷相比水溶性極高之醫藥品原料，可以得到更有利的優勢。 1. α-葡糖基橘皮苷之結晶
    本發明為α-葡糖基橘皮苷之新穎結晶，詳細而言，係與具有後述之空間群、晶格常數、及晶系，進而其氧原子及碳原子具有後述表3及表4所示之原子座標之α-葡糖基橘皮苷結晶相關者。本發明之α-葡糖基橘皮苷之新穎結晶，經由X光結晶構造解析，具有解析其結晶構造充分的性狀之α-葡糖基橘皮苷所構成，適用於單結晶的形態。
    在本說明書所謂「解析結晶構造充分性狀的結晶」，係意味著具備例如，
    (1)固體(結晶)中同一的分子，其為具有一定的規則性以3次元配列者，實質地不包含附著二個以上單結晶之雙晶或微細的單結晶互相固著之多結晶；
    (2)適當的結晶形狀與大小；例如，至少1邊成長為約0.1~約0.5mm之角型柱狀、板狀、或針狀的結晶，期望3邊皆同樣成長之角型柱狀、板狀的結晶或寬度、厚度為約0.02mm以上之結晶為佳。進而更期望以0.1×0.1×0.1mm至0.3×0.3×0.3mm程度大小的結晶為佳。
    (3)具有化學的安定性、力學的安定性、物理學的安定性；特性之結晶。
    本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶，經由X光結晶構造解析，只要它是具有解析其結晶構造充分的性狀之結晶，藉由作為α-葡糖基橘皮苷全體之純度並不限定於此，通常以具有95%以上純度之α-葡糖基橘皮苷為佳，較佳為98%以上，更佳為99%以上。
    在本說明書所謂「α-葡糖基橘皮苷之純度」，係指將溶液、非晶質粉末、含有結晶粉末、結晶等形態之α-葡糖基橘皮苷試料，經由純化水稀釋或溶解成0.1%(w/v)，藉由0.45μm膜過濾器進行過濾後，依照下述條件供給HPLC分析，以試藥橘皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質使用，以在UV280nm色譜圖上所出現的峰值面積與α-葡糖基橘皮苷、7-O-β-葡糖基橘皮苷素(以下，只稱為「7-葡糖基橘皮苷素」)、橘皮苷、其他的配糖體各成分之分子量為基礎進行計算，換算成酸酐質量的組成上α-葡糖基橘皮苷之含量。 <HPLC分析條件>
    HPLC裝置：『LC-20AD』(島津製作所股份公司製)
    除氣器：『DGU-20A3』(島津製作所股份公司製)
    管柱：『CAPCELL PAK C18 UG 120』(資生堂股份公司製)
    試料注入量：10μl
    洗脫液：水/乙腈/醋酸(80/20/0.01(容積比))
    流速：0.7ml/分
    溫度：40℃
    檢出：UV檢測器『SPD-20A』(島津製作所股份公司製)
    測定波長：280nm
    資料處理裝置：『Chromatographic PackC-R7A』(島津製作所股份公司製)
    (1)α-葡糖基橘皮苷含量：在HPLC分析，以試藥橘皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質以峰值面積為基礎進行定量，算出換算分子量。
    (2)橘皮苷含量：在HPLC分析，以試藥橘皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質以峰值面積為基礎進行定量。
    (3)7-葡糖基橘皮苷素：在HPLC分析，以試藥橘皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質以峰值面積為基礎進行定量，算出換算分子量。
    (4)其他的配糖體：在HPLC分析，以試藥橘皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質以峰值面積為基礎進行定量。
    一般單結晶可在偏向顯微鏡之下確認消光，如有必要，經由預先在偏光顯微鏡下觀察α-葡糖基橘皮苷的結晶，可以選別出單結晶與其以外的結晶。又，α-葡糖基橘皮苷之結晶，直接供於X光結晶構造解析，亦即，該領域具備通常技術者以眾知的X光衍射進行單結晶構造解析(例如，參照櫻井敏雄著「X光構造解析指南」，裳華房發行(1983年)等)，藉由是否能得到如後述圖3上所示X光衍射圖案(衍射斑點)進行判斷，可以判斷是否具有解析其結晶構造之充分性狀。在單結晶構造解析，市售的單結晶X光衍射裝置，例如，可用理學股份有限公司製的成像板單結晶自動X光構造解析裝置「R-AXIS RAPID」等，該等市售的單結晶X光衍射裝置上，已先搭載構造解析用的電腦軟體。
    α-葡糖基橘皮苷之結晶，經由X光結晶構造解析，若為具有解析其結晶構造之充分性狀之單結晶時，藉由該解析，在該單結晶上決定結晶學的參數，再來，可得到α-葡糖基橘皮苷分子的原子座標(表示各原子空間的位置關係之值)及3次元構造模型。具體而言，α-葡糖基橘皮苷的原子座標可經由包含(1)於本發明的α-葡糖基橘皮苷結晶上照射單色化X光，得到X光衍射圖型之步驟；(2)得到來自該X光衍射圖型之X光衍射強度數據之步驟；(3)經由直接法(Program「SIR92」，A.Altomare等，Journal of Applied Crystallography(J.Appl.Cryst.)，第27卷、435頁、(1994年))，得到初期構造(電子密度圖)之步驟；(4)以α-葡糖基橘皮苷之化學構造為基礎，在電子密度圖上各自分配碳原子、氧原子、氫原子，以將R值成為最小之最小二乘法進行精密化構造之步驟；之順序，得到作為原子座標。
    順便一提，關於氫原子，單結晶之規格比較的小，在X光衍射強度較弱時有時無法決定原子座標。即使在這樣的情況下，只有非氫原子(α-葡糖基橘皮苷的情況為氧原子與碳原子)之原子座標通過分子建模的基礎，可瞭解到α-葡糖基橘皮苷分子的基本3次元構造。
    根據X光衍射強度數據，可決定本發明結晶的結晶學參數。本發明之結晶其空間群為P21，單位格子的晶格常數為a=13.983Å、b=7.620Å、c=20.065Å，且為α=γ=90°、β=93.475°之單斜晶系(monoclinic)。本結晶，經由X光結晶構造解析，具有解析其結晶構造之充分性狀之單結晶，本發明之結晶，只要它是具有上述空間群、晶格常數、及晶系之結晶，並不限定於作為整體的單晶體形態上者。
    本發明之α-葡糖基橘皮苷結晶，更具體而言，為在結晶上具有α-葡糖基橘皮苷分子之各氧原子及各碳原子如後述表3及4(續表3)所示之原子座標者，提供於圖4所示之ORTEP圖。
    還有，本說明書所謂「實質地由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成之粉體」，在製法上或是技術上的理由無法完全排除其存在之雜物以外，係意味幾乎其全量具有上述結晶學的參數之本發明的α-葡糖基橘皮苷結晶所構成之粉體，在如此粉體上α-葡糖基橘皮苷的純度，通常為95.0%以上，理想為98.0%以上，更加理想為99.0%以上。又，在本說明書所謂「粉體」，係意味比粉末，例如、包含粒體、造粒物、成形體之固體粒子的集合體。
    順便一提，在橘皮苷，藉由其3’-羥基-4’-甲氧基苯基的立體配置不同存在R體與S體之2種光學異構物，S體為天然存在，在水溶液中經由加熱等其立體配置容易反轉變成與R體之混合物。從而，從橘皮苷經由糖轉移反應所製造之α-葡糖基橘皮苷，通常作為光學異構物之R體與S體成為混合存在。α-葡糖基橘皮苷之R體及S體如下述化學式1及2所示。
    化學式1：α-葡糖基-(R)-橘皮苷
    化學式2：α-葡糖基-(S)-橘皮苷
    為橘皮苷之光學異構物之R體與S體，可用光學解析管柱經由HPLC進行分離定量，α-葡糖基橘皮苷之R體、S體可依相同方法進行分析。還有，本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體，如在後述實驗所示，作為光學異構物之R體為70%以上，詳細而言，含有70%以上未滿80%。 2. α-葡糖基橘皮苷結晶之製造方法
    以下，對於本發明之α-葡糖基橘皮苷結晶之製造方法進行說明。
    製造本發明之α-葡糖基橘皮苷結晶之原料的α-葡糖基橘皮苷由來必沒有特別限定，可藉由有機合成法所得到者，亦可藉由酵素合成法所得到者。通常，在橘皮苷共存下用環麥芽糊精葡聚糖轉移酶作用在澱粉之部分分解物上(以下，簡稱為「CGTase」)，接著，使葡萄糖轉化酵素作用，進而經由純化所得到之α-葡糖基橘皮苷為合適的。藉由此酵素合成法所得到之含有α-葡糖基橘皮苷粉末，含有來自其製造方法之雜物。本說明書所謂「來自製造方法之雜物」，係意味為製造原料之橘皮苷以微量狀態本來就混合在類似橘皮苷之配糖體(以下，本說明書單簡稱為「其他之配糖體」)，在糖轉移反應所殘留之未反應的橘皮苷、未反應橘皮苷使具有α-L-鼠李糖苷酶活性之酵素作用進行分解時該分解產物為7-葡糖基橘皮苷素等。
    調製本發明結晶所用之α-葡糖基橘皮苷，只要具有形成結晶充分高之純度即可。α-葡糖基橘皮苷之純度，可經由慣用的純度確認手段(例如，前述HPLC分析)進行確認。做為為了製造結晶之原料之α-葡糖基橘皮苷含有物，通常具有純度為90%以上之α-葡糖基橘皮苷者為佳，理想為95%以上、更理想為98%以上，進而更理想為99%以上。
    有機化合物之結晶化，通常含有該有機化合物之溶液經由在過飽和狀態，從溶液狀態變成非溶解狀態，滿足特定條件時，基於作為結晶析出之性質進行。α-葡糖基橘皮苷之結晶化，具體為可藉由(1)添加α-葡糖基橘皮苷於醇水溶液，加熱使其溶解；(2)降低溶解α-葡糖基橘皮苷溶液之溫度，成為過飽和狀態；(3)在過飽和狀態之α-葡糖基橘皮苷溶液，保持在一定溫度使其析出結晶；之操作來進行。又，如有必要可經由添加種結晶促進結晶化。
    順便一提，在前述日本第3833811號公報，純化至純度81%或85%之α-葡糖基橘皮苷之凍結乾燥固形物(非晶質粉末)加入99%(v/v)甲醇溶液，在80℃下加熱溶解後，放置於室溫下使其析出結晶，以99%(v/v)甲醇溶液洗淨，經由使其乾燥之方法製造含有α-葡糖基橘皮苷結晶之α-葡糖基橘皮苷高含有物。但是，再現此日本特許第3833811號公報所記載之結晶化方法時，α-葡糖基橘皮苷，如圖7我示，係微小結晶成為相互固著之塊狀結晶。用如此之結晶，解析α-葡糖基橘皮苷之結晶構造是不可能的，又該結晶也並不能確定係由單一結晶形所構成者。
    作為用於調製本發明結晶之溶劑，以使用甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、n-丁醇、異丁醇、t-丁醇等之碳數為1至4之低級醇與水混合之醇水溶液為佳。例如，作為溶劑使用甲醇水溶液時，甲醇濃度，通常為80%(v/v)以下，較佳為60%(v/v)以下，更佳為30至40%(v/v)。甲醇濃度超過80%(v/v)時，也依據α-葡糖基橘皮苷之濃度，結晶急遽析出，因為微小結晶生成為相互固著之塊狀結晶故不適宜。又，醇濃度太低時會發生結晶不析出或析出成長需要長時間等之不便。
    溶解於上述低級醇水溶液之α-葡糖基橘皮苷的濃度只要為適合結晶化之濃度即可，通常為0.1~20%(w/v)，較佳為0.5~10%(w/v)，更佳為1~5%(w/v)。結晶化時α-葡糖基橘皮苷濃度比20%(w/v)高時，依據溶劑之醇濃度，結晶急劇析出，因為微小結晶生成為相互固著之塊狀結晶故不適宜。又，α-葡糖基橘皮苷濃度低於0.1%(w/v)時會發生結晶不析出或析出成長需要長時間等之不便。
    溫度條件，α-葡糖基橘皮苷之濃度，也依據溶劑之醇濃度，通常為0~50℃，較佳為3~30℃，更佳為4~10℃。
    得到結晶之後，用實體顯微鏡從出晶之結晶選別適合於X光結晶構造解析尺寸之結晶。要極力避開由複數結晶所貼合者、具龜裂者、察覺到白濁者、表面上有微結晶固著者。又，為了避開在結晶之表面從母液進而析出微結晶，可以有利地實施以結晶為目的來塗佈巴拉東油(Paratone oil)。如此所得到之結晶可用於X光結晶構造解析。
    本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶或實質地由該結晶所構成之粉體，高度地純化該結晶構造到可以解析水準之純度，為被結晶化，被調製之高品質α-葡糖基橘皮苷。本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶及實質地由該結晶所構成之粉體，其本身，作為有效且安全之穩定醫藥品原料，與橘皮苷同樣作為各種疾病的預防或治療劑使用不只是對病毒性疾病、細菌性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤等橘皮苷為有效，同樣對於作為解釋α-葡糖基橘皮苷之溶解性、安定性等之固體物理性、或結晶多態的有無或轉移現象之試藥亦極為有用。
    本發明之α-葡糖基橘皮苷之結晶及實質地由該結晶所構成之粉體作為醫藥品原料使用時之劑形並沒有特別制限，可依固狀、粉末、顆粒、錠劑等之形態使用，也可以與其他醫藥品原料之組成物形態來使用。
    以下，以參考例及實施例為基礎對本發明作進一步更詳細說明。但是，本發明並非藉由這些實例被限定於此。 <參考例：高純度α-葡糖基橘皮苷非晶質粉末之調製>
    用於化妝品之含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質粉末(商品名「α葡糖基橘皮苷」，α-葡糖基橘皮苷含量83.8%，林原股份公司生物體化學研究所販賣)(以下，稱為「試料1」)作為高純度α-葡糖基橘皮苷非晶質粉末之調製原料來使用。亦即，將200g的試料1懸濁在134ml 80%(v/v)乙醇水溶液中，加熱至80℃同時進行攪拌在完全使其溶解後，冷卻至室溫並在室溫放置5天後析出結晶，結晶變成相互固著之嵌段狀。得到之結晶嵌段以80%(v/v)乙醇水溶液約200ml進行洗淨，經由利用濾紙(No.131，Advantech東洋股份有限公司製)過濾回收結晶，於45℃乾燥5小時之後，用研缽進行粉碎得到15.3g之含有α-葡糖基橘皮苷結晶之粉末(以下，稱為「試料2」)。在試料2上其α-葡糖基橘皮苷純度為96.3%。
    上述所得到15g的試料2溶解於濃度調製成12.5%(w/v)之純化水中，0.22μm的膜過濾器所過濾後之物分成3次約各5g經由下述條件供於ODS管柱層析。 <ODS管柱層析條件>
    裝置：『CCCP-D』(東曹股份公司製)
    管柱：『YMC-Pak ODS-AQ』(內徑50mm×長500mm)(YMC股份有限公司製)
    試料注入量：40ml
    洗脫液：35%(v/v)甲醇水溶液
    流速：40ml/分
    溫度：40℃
    檢出：差示折射計『Shodex RI-102』(昭和電工股份有限公司製)
    數據處理裝置：『Chromatographic PackC-R7A』(島津製作所股份公司製)
    餾分：50ml/分餾物
    在以ODS管柱層析所得到之各分餾物對α-葡糖基橘皮苷純度以HPLC分析進行測定，收集純度98%以上之分餾物，經由普通方法進行凍結乾燥，得到13.2g純度99.0%含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末(以下，稱為「試料3」)。
    上述試料1至3，亦即，用於化妝品之含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質粉末、含有α-葡糖基橘皮苷結晶之粉末、以及含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末的組成總結在表1。
    在試料1經由用80%(v/v)乙醇之結晶化使α-葡糖基橘皮苷純度從83.8%上昇至96.3%，為雜物之7-葡糖基橘皮苷素含量從12.3%下降至0.5%，其他的配糖體的含量只有少許下降。接著由進行ODS管柱層析使α-葡糖基橘皮苷純度從96.3%上昇至99.0%，其他的配糖體的含量下降至0.9%。最終得到為了調製結晶所使用之純度99.0%含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末(試料3)。 [實施例1] <α-葡糖基橘皮苷單結晶之調製>
    添加上述參考例所得到3g含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末(試料3)於150ml之30%(v/v)甲醇水溶液，進行攪拌同時加熱至80℃使其完全溶解，接著，所得到之溶液經由於4℃保持14天而結晶化。所得到之結晶懸濁液的顯微鏡照片例示於圖1。如圖1所看到一般，觀察到比較大的無色板狀的結晶析出。從長出結晶的α-葡糖基橘皮苷之結晶，收集適當的大小者於接續數位顯微鏡(「MX-1200II/NDL」，Nakaden股份有限公司製)之實體顯微鏡下，立刻於巴拉東油(Paratone oil)塗佈之後，搭載於試料支持器上，作為X光結晶構造解析用試料。
    取得X光結晶構造解析用之結晶所殘留之結晶懸濁液，用濾紙(No.4，Advantech東洋股份有限公司製)經由桐山漏斗進行過濾而回收結晶之後，乾燥而得到α-葡糖基橘皮苷之結晶約1.2g。還有，本結晶品之α-葡糖基橘皮苷純度為99.3%。 [實施例2] <α-葡糖基橘皮苷之單結晶X光結晶構造解析>
    在實施例1搭載試料支持器之α-葡糖基橘皮苷之單結晶，設定在單結晶X光衍射裝置(「R-AXIS RAPID-R」，理學股份有限公司製)，於氮氣(-170℃)環境下，經由振動照片法以下述之條件測定X光衍射圖案。 <X光衍射圖案測定條件>
    X光源：Cu
    出力：50kV，100mA
    入射X光：CuK α線(λ=1.54187Å)
    入射X光尺寸：約0.5mm
    結晶尺寸：0.10×0.10×0.03mm
    檢測器：成像板
    測定溫度：約-170℃(氮氣噴塗法)
    經由X光衍射用於單結晶構造解析的α-葡糖基橘皮苷結晶之實體顯微鏡照片在圖2上，各自展示其X光衍射圖案之一例於圖3上。在X光衍射圖案，多數衍射斑點(Spot)被確認，確認出該結晶為單結晶。還有，X光衍射峰值的形狀為比較良好者，其峰值強度為弱化。觀測到在39,960個的反射(衍射)內，固有的反射為7,806個。
    以上述X光衍射圖案的X光衍射強度為基礎，按直接法求得初期構造的同時，以α-葡糖基橘皮苷之構造式作為參考作成構造模型，進而基於4,739個的反射經由最小二乘法使其精密化。還有，作為解析軟體，使用理學股份有限公司製的「Crystal Structure Ver.3.8.2」。藉由X光結晶構造解析所得到之α-葡糖基橘皮苷之結晶學的數據總結在表2。
    如表2所示，從所得到之X光衍射強度數據，結晶所屬的晶系決定為單斜晶系(monoclinic)，空間群為P21，晶格常數為a=13.983Å、b=7.620Å、c=20.065Å、α=γ=90°、β=93.475°、V=213395Å3。又，表示每結晶之單位格子的α-葡糖基橘皮苷分子數之Z值成為2，在本結晶，判斷每結晶之單位格子含有2分子的α-葡糖基橘皮苷。 <分子構造及結晶構造之解析>
    按照直接法解析之結果，在α-葡糖基橘皮苷分子上其氫原子雖為無法鑑別者，對於非氫原子(碳原子及氧原子)之基本骨架，可基於α-葡糖基橘皮苷之構造訊息於各原子位置上配置元素。經由座標數據之精密化得到在α-葡糖基橘皮苷分子上之各氧原子及碳原子的原子座標(x，y，z)與各自之各向同性(Isotropy)溫度因子(Beq)之值表示於表3及4(續表3)上。又，展示在α-葡糖基橘皮苷分子上除氫原子之外各原子間的距離於表5上，又，各自展示除氫原子之外各原子間的結合角度於表6及表7(續表6)上。
    進而，展示從精密化座標數據來計算表示α-葡糖基橘皮苷之ORTEP圖於圖4。又，每結晶單位格子之α-葡糖基橘皮苷分子的包裝構造，作為從b軸方向所見情形之結晶構造圖表示於圖5。還有，在表3至7其氧原子及碳原子之號碼各自對應記載於圖4之α-葡糖基橘皮苷的ORTEP圖上之氧原子及碳原子的號碼。又，在表3至7上各數值其括號內的數值意味著標準偏差。


    還有，在圖4所示ORTEP圖上，各自展示碳號碼C1至C16在α-葡糖基橘皮苷分子上之橘皮苷素構造、碳號碼C17至C28蘆丁糖(Rutinose)(L-吡喃鼠李糖基(rhamnopyranosyl)(α 1→6)葡萄糖)之構造、又碳號碼C29至C34構成蘆丁糖(Rutinose)構造之葡萄糖4位羥基上通過α-葡萄糖苷結合所結合之葡萄糖構造。另一方面，從圖5所示結晶構造圖，在本結晶，可理解每單位格子係由2分子之α-葡糖基橘皮苷所包裝。 [實施例3] <α-葡糖基橘皮苷結晶之調製>
    添加上述參考例所得到2g含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末(試料3)於50ml之40%(v/v)甲醇水溶液，進行攪拌同時加熱至80℃使其完全溶解，接著，所得到之溶液經由於10℃保持10天而結晶化。得到與實施例1所得同樣無色、板狀之結晶。本結晶也與實施例1得到之結晶同樣可用於X光結晶構造解析。結晶懸濁液，利用濾紙(No.4，Advantech東洋股份有限公司製)經由桐山漏斗進行過濾而回收，得到α-葡糖基橘皮苷之結晶約0.9g。還有，本結晶品之α-葡糖基橘皮苷純度為99.1%。 [實施例4] <在α-葡糖基橘皮苷結晶上其光學異構物存在比之測定>
    於實施例1及3所得到α-葡糖基橘皮苷結晶上其α-葡糖基橘皮苷之光學異構物存在比，用光學解析管柱調查。
    各結晶品約2mg，各自溶解於10ml洗脫液(20mm磷酸1鉀水溶液(pH3.0)/乙腈(86/14))，在下述所示條件供於光學解析HPLC，測定光學異構物之存在比。作為實施例1之結晶色譜圖一個例子表示於圖6。又，各結晶品之分析結果表示於表8。 <HPLC分析條件>
    HPLC裝置：
    管柱：『SUMICHIRAL OA-7000』(4.6×250mm)(住化股份有限公司分析中心製)
    試料注入量：10μl
    洗脫液：20mm磷酸1鉀水溶液(pH3.0)/乙腈(86/14)
    流速：0.4ml/分
    管柱溫度：35℃
    檢出：UV280nm
    數據處理裝置：『Chromatographic PackCR-4A』(島津製作所股份有限公司製)
    在色譜圖上將α-葡糖基橘皮苷之R體及S體的峰值面積比作為存在比。
    如圖6所示，在本分析條件下其α-葡糖基橘皮苷之R體及S體峰值經由光學解析管柱完全分離，各自於保持時間(Rt)31.4分鐘及34.9分鐘溶出。從表8可清楚瞭解，在實施例1所得到的α-葡糖基橘皮苷之結晶品作為光學異構物之R體與S體之比率約為8：2，實施例3之結晶品同比率為約7：3，所以R體之存在比較高。 [實施例5] <實質上由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成之粉體的製造方法>
    添加以參考例之方法所得到之含有α-葡糖基橘皮苷之非晶質凍結乾燥粉末4質量份於100質量份35%(v/v)甲醇水溶液，經由進行攪拌同時加熱至80℃使其完全溶解，接著，所得到之溶液經由於10℃保持14天而結晶化。得到與實施例1所得同樣無色、板狀之結晶。結晶懸濁液經由進行過濾而回收之後，乾燥後得到實質上由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成的粉體約2質量份。還有，本品之α-葡糖基橘皮苷純度為99.2%。本品，可適合用於作為醫藥品原料等。 [實施例6] <錠劑>
    以實施例5之方法所得到實質上由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成之粉體20質量份、麥芽糖30質量份、及玉米澱粉4質量份均勻地混合之粉末經以一般方法在壓錠機上製造1錠0.5g之錠劑。本品，不只作為維生素P補給劑、作為血管系疾病治療劑、關節疾病治療劑等可有利地使用。 [實施例7] <複合維生素劑>
    對於L-抗壞血酸鈉(試藥級，和光純藥工業股份有限公司販賣)10質量份，加上以實施例5之方法所得到之實質上由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成之粉體15質量份，以通用攪拌機混合後，放置一晚，進行粉碎，調製粉末狀之複合維生素劑。本品，經由α-葡糖基橘皮苷使L-抗壞血酸安定化，不只是維生素C缺乏症及維生素P缺乏症的預防或治療，也可利用在對微血管的強化、胃腸疾病的改善等目的上。 [實施例8] <使用前溶解型注射劑>
    添加以參考例的方法所得到之α-葡糖基橘皮苷含有非晶質凍結乾燥粉末3質量份於150質量份35%(v/v)甲醇水溶液，經由進行攪拌同時加熱至80℃使其完全溶解後，依從普通方法進行精密過濾以去除致熱質，全部操作除了擔心致熱質的混入之外，與實施例1以同樣方式將α-葡糖基橘皮苷進行結晶化，乾燥之後進行粉碎，得到實質上由α-葡糖基橘皮苷之結晶所構成的無熱原的粉體約1質量份。還有，本品之α-葡糖基橘皮苷純度為99.3%。將此50mg粉體置入無菌的20ml容安瓿瓶中，以氮氣取代之後，進行封管，成為包含安瓿瓶之使用前溶解型注射劑。本品，以單體，或與其他維生素、礦物質等混合可投藥於筋肉內或靜脈內，不只是作為維生素P補給劑，作為血管系疾病治療劑、關節疾病治療劑等可有利地使用。 [實施例9] <α-葡糖基橘皮苷對細胞的自噬作用之影響效果>
    使用以實施例3的方法所得到之α-葡糖基橘皮苷其純度為99%以上之結晶α-葡糖基橘皮苷標品，調查α-葡糖基橘皮苷對細胞的自噬作用，亦即，細胞經由積極地排除蓄積在細胞內不要蛋白質、損傷的線粒體等預防疾病現象上之影響效果。以係免疫系細胞之HOZOT細胞(參照再公表專利WO2007/105797)或為神經細胞株之SH-SY-5株作為試驗對象，將α-葡糖基橘皮苷，添加成在HOZOT細胞時最終濃度為1或10μM，在SH-SY-5株時最終濃度為10或25μM之培養液，經24小時處理後回收細胞，各自調製細胞萃取液。接著，將細胞萃取液供於SDS-PAGE之後，藉由西方氏轉漬法測定係自噬作用標記蛋白的LC-3B之表現量。作為試驗細胞使用HOZOT細胞時的結果如表9，使用SH-SY-5株時的結果如表10各自所示。

    從表9可清楚理解，在HOZOT細胞時，以1μM之α-葡糖基橘皮苷進行處理，其LC-3B之表現量增加為無處理(對照1)的4.6倍。此α-葡糖基橘皮苷的效果，比所知具自噬作用之促進作用的藥劑MG-132(對照2)更強，又，與噻唑烷二酮(對照3)為相同程度。另一方面，從表10清楚理解，在SH-SY-5株時，以10μM或25μM之α-葡糖基橘皮苷進行處理，其LC-3B之表現量增加為無處理(對照1)之約6.3倍或約7.5倍。此效果，比以1μM之噻唑烷二酮(對照3)所處理的情形更強。從此等之結果，可判斷α-葡糖基橘皮苷作為細胞之自噬作用促進劑係有用的。自噬作用，已知與亨廷頓氏病所代表之神經變性疾病或2型糖尿病等相關連，具有細胞的自噬作用促進作用之α-葡糖基橘皮苷可應用於對此等疾病之治療。 [產業上的利用可能性]
    本發明，其係提供一種已確定結晶構造之α-葡糖基橘皮苷的新穎結晶與實質地由該結晶所構成之粉體、以及作為該醫藥品原料用途者。與本發明相關之α-葡糖基橘皮苷之結晶及實質地由該結晶所構成之粉體，其本身作為有效且安全的穩定醫藥品原料，與橘皮苷同樣、不僅可用作為橘皮苷有效的病毒性疾病、細菌性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤等各種疾病的預防或治療劑使用，同樣對於作為解析α-葡糖基橘皮苷之溶解性、安定性等之固體物理性、或結晶多態的有無或轉移現象之試藥也極為有用。本發明，作為α-葡糖基橘皮苷之醫藥品原料的用途被大大開拓出來，其產業上的有用性極大。
    [圖1]為用30%(v/v)甲醇水溶液藉由結晶化所得到之α-葡糖基橘皮苷結晶之顯微鏡照片之一例(倍率：250倍)。
    [圖2]為用於X光結晶構造解析之α-葡糖基橘皮苷結晶(0.1×0.1×0.03mm)的實體顯微鏡照片。
    [圖3]為α-葡糖基橘皮苷結晶的X光衍射圖案之一個例子。
    [圖4]為去除氫原子之α-葡糖基橘皮苷之ORTEP圖。
    [圖5]為在結晶單位格子上表示α-葡糖基橘皮苷分子包裝的結晶構造圖(b軸方向)。
    [圖6]為用於X光結晶構造解析之α-葡糖基橘皮苷結晶供於光學解析HPLC時之色譜圖。
    [圖7]為使用99%(v/v)甲醇溶液經由結晶化所得到之α-葡糖基橘皮苷結晶之顯微鏡照片之一例(倍率：500倍)。
    权利要求:
    Claims (6)
    [1] 一種α-葡糖基橘皮苷之結晶，其結晶之空間群為P21，單位格子的晶格常數為a=13.983Å、b=7.620Å、c=20.065Å，且為α=γ=90°、β=93.475°之單斜晶系(monoclinic)。
    [2] 如申請專利範圍第1項之結晶，其中構成α-葡糖基橘皮苷分子之氧原子及碳原子具有如表3及表4所示之原子座標。
    [3] 如申請專利範圍第1項或第2項之結晶，其為單結晶之形態。
    [4] 一種粉體，其係實質地由申請專利範圍第1項至第3項之任一項所記載之結晶所構成。
    [5] 如申請專利範圍第1至3項所記載之結晶或如申請專利範圍第4項之粉體，其中，供於使用光學解析管柱之高速液體層析分析時，含有70質量%以上作為光學異構物之α-葡糖基-(R)-橘皮苷。
    [6] 如申請專利範圍第1至3項所記載之結晶或如申請專利範圍第4項之粉體，其係作為醫藥品原料。
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    法律状态:
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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